要先對PCR目的(de)序列的(de)長度(du)有個(ge)大致估計：

第一(yi)步：找到Primer3的站點。你(ni)不用記住這(zhe)(zhe)個(ge)站點，但(dan)是要(yao)記住“Primer3”這(zhe)(zhe)個(ge)詞，然后打開GOOGLE首頁(ye)，輸入Primer3，跳出(chu)來的第一(yi)個(ge)項目就是了“”

網址是。

第二步：貼上模板序(xu)列。進入Primer3站點，可以看到一個(ge)引物設計的(de)(de)界面(mian)。在“Paste?source sequence?below (5'->3'…..”下面(mian)的(de)(de)大空框里(li)面(mian)把你的(de)(de)模板序(xu)列粘帖(tie)進去。注意(yi)是5'->3'方(fang)向的(de)(de)，數(shu)字或者空格都沒關系，軟件會自動過濾的(de)(de)。

第三步：重要參數設定。首先是“Product Size Ranges”，如果你不希望軟件給你隨便做的話，首先要調整的就是這個參數。默認的參數實際上是從100到1000，這個你得自己改，如果你希望產物的大小符合你的預期，盡可能把范圍改小，比如480-500，具體看情況調整。第二個參數是“Primer Size”，默認值一般可以用，但是，當你用熟了這個軟件，你自己就知道該怎么改了。第三個參數是”Primer Tm”這個和Primer Size差不多。

第四步(bu)：Pick primers：?點(dian)一下這個按鈕，符合你(ni)(ni)大(da)小預期(qi)的primer就出來了，看看Primer3 Output的界面，多么(me)漂亮(liang)！你(ni)(ni)要(yao)的primer出來了，而且有(you)primer在(zai)序列(lie)上的位置(zhi)比對圖，還要(yao)primer本身的信息，包括位置(zhi)，長(chang)度，Tm，GC含量，任何(he)位置(zhi)互(hu)補堿基數(shu)，3'端(duan)互(hu)補堿基數(shu)，以及引(yin)(yin)(yin)物序列(lie)，（注意，下游(you)引(yin)(yin)(yin)物是5'->3'），還要(yao)產物大(da)小，兩引(yin)(yin)(yin)物間任意互(hu)補堿基數(shu)，兩引(yin)(yin)(yin)物間3'端(duan)互(hu)補堿基數(shu)等。如果引(yin)(yin)(yin)物尚在(zai)參數(shu)設定的范圍內，但還不(bu)是最佳，將會給(gei)出警告。

第五步：引(yin)(yin)(yin)物設計檢驗：可(ke)(ke)以(yi)僅僅設計一向(xiang)引(yin)(yin)(yin)物，只要在(zai)Pick?left?primer或者Pick?right?primer前面的(de)(de)勾勾掉(diao)一個就可(ke)(ke)以(yi)。也(ye)可(ke)(ke)以(yi)自(zi)己定義(yi)引(yin)(yin)(yin)物，放(fang)(fang)在(zai)Primer框(kuang)里，（注意，下游引(yin)(yin)(yin)物的(de)(de)書寫反(fan)向(xiang)仍(reng)然是5'->3'）如(ru)果符(fu)合(he)設定的(de)(de)條件，軟件將對(dui)給(gei)出引(yin)(yin)(yin)物評分(fen)，同時(shi)給(gei)出警告(gao)(gao)信息，根據警告(gao)(gao)信息可(ke)(ke)以(yi)適當對(dui)自(zi)定義(yi)引(yin)(yin)(yin)物做(zuo)些調整即可(ke)(ke)，警告(gao)(gao)信息也(ye)讓你做(zuo)實驗的(de)(de)時(shi)候心中有(you)數。對(dui)于文(wen)獻發表的(de)(de)引(yin)(yin)(yin)物，最好都要檢查(cha)一下，這樣就可(ke)(ke)以(yi)避(bi)免被(bei)別人有(you)意無意誤導。至于RT-PCR所(suo)用的(de)(de)引(yin)(yin)(yin)物，最好是使得產(chan)物跨過內(nei)含(han)(han)子，這樣避(bi)免潛在(zai)DNA對(dui)RT-PCR的(de)(de)干擾。實際做(zuo)引(yin)(yin)(yin)物的(de)(de)時(shi)候，要把(ba)內(nei)含(han)(han)子都去掉(diao)，僅僅把(ba)外(wai)(wai)顯子序(xu)列放(fang)(fang)入源序(xu)列框(kuang)中，并且通過自(zi)定義(yi)引(yin)(yin)(yin)物設計的(de)(de)方法，使上下游引(yin)(yin)(yin)物分(fen)別全部或者部分(fen)落在(zai)不同外(wai)(wai)顯子上。至于如(ru)何快速識別內(nei)含(han)(han)子和外(wai)(wai)顯子以(yi)及電子PCR，我將抽空另做(zuo)說明(ming)。

至于設計出來的引(yin)(yin)物(wu)的實(shi)際效果，根據我的經(jing)驗，一(yi)般情況下都能做到PCR一(yi)次成(cheng)功，也許隨(sui)便那一(yi)段序列做引(yin)(yin)物(wu)也能達到很好的效果，但是不管怎么說，軟件做引(yin)(yin)物(wu)可(ke)以(yi)讓(rang)自己心中(zhong)有數。最后，GOOD LUCK TO EVERYONE.