M-MLV?逆轉錄酶

產品說明

M-MLV逆(ni)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)酶是(shi)由一個?71 kD的(de)單(dan)亞(ya)基組成的(de)重組型DNA逆(ni)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)聚合(he)(he)酶。可以(yi)催化以(yi)RNA或DNA：RNA雜交(jiao)鏈(lian)為模板的(de)互補(bu)DNA?的(de)聚合(he)(he)反應。本酶經(jing)修飾RNase H活性比普(pu)通的(de)逆(ni)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)錄(lu)酶要弱很多，因此在(zai)合(he)(he)成第一鏈(lian)cDNA的(de)過程(cheng)中，可保證RNA的(de)降(jiang)解程(cheng)度較低(di)，從而使(shi)得率提高(gao)。

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產品組分

R1041可(ke)進行25次逆(ni)轉錄反應，R1042可(ke)進行50次逆(ni)轉錄反應（20 μl?標準(zhun)?PCR?反應體系，每(mei)次使(shi)用?M-MLV 1 μl）。

M-MLV?儲存液成分

20 mM Tris-HCl (pH 7.5)，200 mM NaCl，0.1 mM EDTA，1 mM DTT，0.01% NP-40，50% glycerol

5x first-strand buffer?成分

250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)，375 mM KCl，15 mM MgCl₂，50 mM DTT

保存條件

-20℃保(bao)存(cun)，避免反復凍(dong)融。

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質量檢測

逆轉錄酶活性檢測

使用[₃₂P]dCTP作(zuo)為(wei)標記，200 U的(de)(de)M-MLV以1μg、1.2 kb的(de)(de)RNA為(wei)模板(ban)進行逆轉錄反應，最低可得(de)到120 ng的(de)(de)cDNA，所得(de)cDNA長(chang)度(du)?>?全長(chang)的(de)(de)90%。

核酸外切酶活性檢測

混合(he)50 ng的標(biao)記(ji)DNA或RNA與200 U M-MLV在(zai)1×反(fan)應緩(huan)沖液體系中，37℃溫浴1 h，檢(jian)測(ce)DNA和RNA降解都(dou)不到總量的1%。

核酸內切酶活性檢測

混合1μgⅠ型(xing)超螺旋質粒(li)DNA與500 U M-MLV在1×反應緩(huan)沖液體系中，37℃溫(wen)浴(yu)1 h，瓊脂(zhi)糖電泳檢測，無明顯的剪切。

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適用范圍

第一鏈cDNA?合成；cDNA?文庫構(gou)建；RT-PCR；引物延伸；3'?和?5' RACE。

注意事項

l??成(cheng)(cheng)功的(de)(de)(de)cDNA合(he)成(cheng)(cheng)來自高(gao)(gao)質(zhi)量的(de)(de)(de)RNA。高(gao)(gao)質(zhi)量的(de)(de)(de)RNA至少應保證全長(chang)的(de)(de)(de)完整性(xing)并且不含逆轉錄酶的(de)(de)(de)抑制(zhi)劑(ji)(ji)，如EDTA或?SDS。用(yong)(yong)于cDNA合(he)成(cheng)(cheng)反(fan)應的(de)(de)(de)溶液試(shi)劑(ji)(ji)盡可(ke)能用(yong)(yong)DEPC進行處(chu)理(li)(li)(li)，并在高(gao)(gao)壓(ya)滅菌(jun)后使用(yong)(yong)。有些試(shi)劑(ji)(ji)不能用(yong)(yong)高(gao)(gao)壓(ya)滅菌(jun)處(chu)理(li)(li)(li)時，首先(xian)用(yong)(yong)經過滅菌(jun)的(de)(de)(de)器具、水等配制(zhi)溶液后，再將溶液進行過濾除菌(jun)處(chu)理(li)(li)(li)。

l??為了增加貯(zhu)存RNA樣(yang)品的(de)穩定(ding)性(xing)，可(ke)(ke)以將RNA溶(rong)解(jie)在去離(li)子(zi)的(de)甲酰胺(an)中，存于(yu)-70℃。用于(yu)保(bao)存?RNA?的(de)甲酰胺(an)一(yi)定(ding)不能含有降解(jie)RNA的(de)雜物。來源于(yu)胰臟的(de)RNA至(zhi)少(shao)可(ke)(ke)以在甲酰胺(an)中保(bao)存一(yi)年。當準備(bei)使用RNA時(shi)(shi)，可(ke)(ke)以使用下列方法沉淀(dian)RNA：加入NaCl至(zhi)0.2 M同時(shi)(shi)加入4倍體積的(de)乙醇(chun)，室溫放置3-5 min，10,000 rpm離(li)心5 min。

l??在逆轉錄反(fan)應中經常加入(ru)RNase抑制(zhi)(zhi)劑（RNasin）以增加cDNA合(he)成的(de)長度(du)和(he)產(chan)量。在第一鏈(lian)合(he)成反(fan)應中，RNase抑制(zhi)(zhi)劑在緩沖(chong)液和(he)還原劑（如(ru)?DTT）存(cun)在的(de)條件下加入(ru)，因為cDNA合(he)成前的(de)過程(cheng)會使(shi)抑制(zhi)(zhi)劑變性，從而(er)釋放出(chu)RNase。但是RNase抑制(zhi)(zhi)劑僅防止(zhi)RNase A，B，C?對RNA的(de)降解，并(bing)不能(neng)防止(zhi)皮(pi)膚上的(de)RNase，因此盡管使(shi)用了RNase抑制(zhi)(zhi)劑，也要小心(xin)不要從手指(zhi)上引(yin)入(ru)RNase。

l??較高的(de)保溫(wen)溫(wen)度有助于RNA二級(ji)結(jie)構的(de)打開，增(zeng)加反應的(de)產量。

l??使(shi)用(yong)簡單的(de)RNA純(chun)化方法即(ji)可獲(huo)得滿(man)足RT-PCR反(fan)應的(de)RNA，但為了保證實驗的(de)成功率(lv)，建議使(shi)用(yong)GTC法（異硫氰酸胍(gua)法）制備的(de)高純(chun)度RNA。

l??為防止RNA降解，應盡量避免反復凍(dong)融，最好保存于-70℃。

l??最佳(jia)的PCR反應條(tiao)件，因PCR擴增(zeng)儀的不(bu)同(tong)而(er)不(bu)同(tong)，所以(yi)在使(shi)用您的樣(yang)品之前最好先試做(zuo)一下control反應，以(yi)確定最佳(jia)的PCR反應條(tiao)件。

l??cDNA產物應置于-20℃保存。

l??當(dang)以cDNA為模板進行PCR之前，使(shi)用RNase H處理(li)cDNA，可以提高PCR反應的靈敏度。

操作步驟

1?在冰(bing)浴的無菌(jun)離心管(guan)中配制下列(lie)混(hun)合物

2?進行變性退火反應

70℃溫浴5 min，簡短離心后冰浴5 min。

3?在上(shang)述離心管(guan)中配制(zhi)反(fan)(fan)轉錄反(fan)(fan)應(ying)液(ye)

4?按(an)下列條(tiao)件進行反轉錄反應

Oligo (dT)₁₅?：42℃溫浴60 min；

Random primer：?37℃溫(wen)浴60 min。

5?終止反應

70℃溫浴(yu)5 min終止反(fan)應，置冰(bing)上進行后續實驗或-20℃保存(cun)。

6?用RNase-free ddH₂O將反應體系稀(xi)釋到50μl，取2-5μl進(jin)行(xing)PCR擴增反應。