TRAzol

產品說明

TRAzol可(ke)以從動物(wu)組織(zhi)、植(zhi)物(wu)材料(liao)、各種(zhong)微(wei)生(sheng)物(wu)以及培養細胞等組織(zhi)材料(liao)中(zhong)(zhong)提(ti)取總RNA。樣品在TRAzol中(zhong)(zhong)能夠充分(fen)被(bei)裂解(jie)，在加(jia)入氯仿離心后(hou)，溶液(ye)會形成上清層(ceng)(ceng)、中(zhong)(zhong)間層(ceng)(ceng)和有機層(ceng)(ceng)（下層(ceng)(ceng)），RNA分(fen)布在上清層(ceng)(ceng)中(zhong)(zhong)，收(shou)集上清層(ceng)(ceng)后(hou)，經(jing)異丙(bing)醇沉淀便可(ke)以回收(shou)得到(dao)總RNA。經(jing)本制品提(ti)取的(de)總RNA純度高，基本不含蛋白(bai)質及基因組DNA，提(ti)取的(de)RNA可(ke)以直接(jie)用于(yu)Northern雜交、斑(ban)點雜交、mRNA純化、體外翻譯、RNA分(fen)解(jie)酶的(de)保護分(fen)析(xi)、RT-PCR、構建cDNA文(wen)庫等各種(zhong)分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)學實驗。

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產品組分

需要自備氯仿、異丙醇、RNase-free 75%乙(yi)醇、DEPC處理水(shui)（R2041/R2042）

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保存條件

室溫運(yun)輸，2-8℃避光保存。

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注意事項

● ??TRAzol具有腐蝕性(xing)，操作過程中(zhong)應做好防(fang)護，避(bi)免直接(jie)接(jie)觸皮膚(fu)或吸入口鼻。沾染后應立即用大量清(qing)水沖洗(xi)，必要(yao)時(shi)請就(jiu)醫處理。

● ??嚴防操作(zuo)環(huan)境、使用的(de)(de)容器、耗材和試劑的(de)(de)RNase污(wu)染。操作(zuo)過程中勤換手套。

● ??根據(ju)起(qi)始材(cai)料量(liang)(liang)的不同使用不同體(ti)積的溶液(ye)（見下(xia)表(biao)）。過多或過少的使用量(liang)(liang)都可(ke)能影響RNA的質量(liang)(liang)或產量(liang)(liang)。若(ruo)起(qi)始材(cai)料量(liang)(liang)很(hen)少，RNA預計產量(liang)(liang)很(hen)低，在(zai)異丙醇沉(chen)淀(dian)時(shi)，可(ke)加入(ru)20 mg/ml肝糖原溶液(ye)0.5-1 μl促進RNA沉(chen)淀(dian)。

● ??不同起始材料試劑用量及(ji)TRAzol用量。

● ??使(shi)用(yong)本產品提取(qu)的RNA一般(ban)不含(han)有DNA污染。在(zai)極少數情況下（與(yu)組織(zhi)pH值(zhi)等相(xiang)關），如果有DNA污染而又必須(xu)去(qu)除，則可以用(yong)RNase-free的DNase處理樣品。

● ??防止DNA污染方法：a.?減少(shao)樣本起始用(yong)量，如將(jiang)100 mg的植物(wu)組織減少(shao)為50 mg，將(jiang)30 mg的動物(wu)組織減少(shao)為10 mg；

????????????????????? b.?在加入(ru)TRAzol之后加入(ru)5-10 ul 3M NaAc(pH5.2)。

● ??請嚴格遵照(zhao)操(cao)作步驟操(cao)作。

●? ?有(you)關RNA的吸光度說明如下：

260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白質等有機物的吸光度值。OD₂₆₀/OD₂₈₀（R）體(ti)現了RNA中的(de)(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)等有機(ji)物的(de)(de)污染程度(du)，質(zhi)量較好的(de)(de)RNA的(de)(de)R值應在1.8-2.0之間(jian)，當(dang)R<;1.8時(shi)，溶(rong)液中的(de)(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)等有機(ji)物的(de)(de)污染比較明顯；當(dang)R>2.2時(shi)，說明RNA已經被水解成了單核(he)苷酸(suan)。在對核(he)酸(suan)進(jin)行吸光(guang)度(du)檢測(ce)時(shi)，需(xu)要注意稀釋(shi)液應使用TE Buffer。

●? ?RNA濃度=（OD₂₆₀-OD₃₂₀）×稀釋倍數×0.04 μg/μl

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操作步驟

1.??????實驗樣品的研磨和勻漿

A.?貼壁培養細胞

倒出培養液，用1X PBS清洗一次，每10 cm²生長的(de)培(pei)養(yang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)中加入1ml的(de)TRAzol，水平放(fang)置(zhi)片刻，使(shi)(shi)裂(lie)解(jie)(jie)液均勻分(fen)布于(yu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)表面(mian)并裂(lie)解(jie)(jie)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)，然(ran)后使(shi)(shi)用移(yi)液槍吹打(da)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)使(shi)(shi)其脫(tuo)落(luo)（對(dui)于(yu)貼壁牢(lao)固的(de)培(pei)養(yang)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)可用細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)刮勺(shao)剝(bo)離(li)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)）。將內(nei)含(han)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)裂(lie)解(jie)(jie)液轉移(yi)至離(li)心管中，用移(yi)液槍反復(fu)吹吸直至裂(lie)解(jie)(jie)液中無明顯(xian)沉淀。室溫(wen)靜置(zhi)5 min。

B.?懸浮培養細胞

將懸浮培養細胞連同培養液一起倒入離心管中，8,000 rpm，4℃離心2 min，棄上清，向每10⁷個細(xi)胞中加入l-2 ml的TRAzol。用移(yi)液槍反復吹吸(xi)直至裂解液中無明顯沉淀，室溫(wen)靜(jing)置(zhi)5 min。

C.?動物(wu)組織(zhi)、植物(wu)材料樣(yang)品

將(jiang)(jiang)超(chao)低溫凍(dong)結的(de)(de)RNA提(ti)取(qu)樣(yang)品(pin)稱量后迅速轉移(yi)(yi)至(zhi)用(yong)液氮(dan)預冷的(de)(de)研(yan)(yan)缽中(zhong)，用(yong)研(yan)(yan)杵(chu)研(yan)(yan)磨(mo)組織，其間不斷加(jia)(jia)入液氮(dan)，直(zhi)至(zhi)研(yan)(yan)磨(mo)成(cheng)(cheng)粉(fen)(fen)末(mo)狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)（無(wu)明(ming)顯的(de)(de)可見顆粒(li)，如果沒有(you)研(yan)(yan)磨(mo)徹(che)底會影響RNA的(de)(de)收率和(he)質量）。對于普通的(de)(de)RNA提(ti)取(qu)樣(yang)品(pin)，可以向研(yan)(yan)缽中(zhong)加(jia)(jia)入適量的(de)(de)TRAzol，將(jiang)(jiang)研(yan)(yan)磨(mo)成(cheng)(cheng)粉(fen)(fen)末(mo)狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)的(de)(de)樣(yang)品(pin)完全覆蓋，然后室溫靜置(zhi)(zhi)，直(zhi)至(zhi)樣(yang)品(pin)完全融化(hua)，再用(yong)研(yan)(yan)杵(chu)繼續研(yan)(yan)磨(mo)至(zhi)裂解(jie)液呈(cheng)透明(ming)狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)。對于特殊樣(yang)品(pin)，如肝、脾、骨及軟骨等，可以將(jiang)(jiang)研(yan)(yan)磨(mo)成(cheng)(cheng)粉(fen)(fen)末(mo)狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)的(de)(de)樣(yang)品(pin)加(jia)(jia)入到含(han)有(you)適量的(de)(de)TRAzol的(de)(de)勻(yun)漿管(guan)中(zhong)，把(ba)勻(yun)漿管(guan)置(zhi)(zhi)于冰浴(yu)中(zhong)進行勻(yun)漿，直(zhi)至(zhi)勻(yun)漿液呈(cheng)無(wu)顆粒(li)透明(ming)狀(zhuang)(zhuang)(zhuang)。將(jiang)(jiang)勻(yun)漿液轉移(yi)(yi)至(zhi)離(li)心管(guan)中(zhong)，室溫靜置(zhi)(zhi)5 min。12,000 rpm 4 ℃離(li)心5 min，小心吸(xi)取(qu)上清液，移(yi)(yi)入新的(de)(de)離(li)心管(guan)中(zhong)（切勿(wu)吸(xi)取(qu)沉淀(dian)）。

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2.??????Total RNA的提取

1??向(xiang)上述步驟中的勻(yun)漿裂(lie)解(jie)液中加入氯(lv)仿(fang)（TRAzol的1/5體積量），蓋緊(jin)離心管蓋，用力振蕩（氯(lv)仿(fang)沸點低(di)、易揮發，振蕩時應小心離心管蓋突然彈開）。待充(chong)分乳(ru)化(hua)溶液呈乳(ru)白狀（無分相現(xian)象）后，再室溫靜(jing)置(zhi)2 min。

2? 12,000 rpm 4 ℃離心10 min。

3??從(cong)離(li)心(xin)(xin)機中(zhong)小心(xin)(xin)取(qu)出離(li)心(xin)(xin)管(guan)，此時勻(yun)漿(jiang)液(ye)分為三層(ceng)，即：無色(se)的上清液(ye)、中(zhong)間的白色(se)層(ceng)及帶(dai)有顏(yan)色(se)的下層(ceng)有機相，吸(xi)取(qu)上清液(ye)轉(zhuan)移至另一新的離(li)心(xin)(xin)管(guan)中(zhong)（切忌吸(xi)出白色(se)中(zhong)間層(ceng)）。

（如(ru)樣品含有較多多糖多酚(fen)，請(qing)增加以下步(bu)驟(zou)：在上(shang)(shang)清(qing)(qing)液中(zhong)加入(ru)0.2X上(shang)(shang)清(qing)(qing)液體(ti)積的(de)5 M NaCl及1X上(shang)(shang)清(qing)(qing)液體(ti)積的(de)酚(fen)/氯仿（1:1），混勻，12000 rpm離心(xin)5-10 min?，取上(shang)(shang)清(qing)(qing)液加入(ru)等體(ti)積氯仿，混勻，12000 rpm?離心(xin)?5-10 min，至第(di)4步(bu)。）

4??向(xiang)上清中(zhong)加入等體積的異(yi)丙(bing)醇(chun)，上下顛倒離心管充(chong)分(fen)混(hun)勻后，在15-30℃下靜置(zhi)10 min。

5? 12,000 rpm 4℃離心10 min。一般在離心后(hou)，試管底部會出現沉淀。

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3.??????RNA沉淀的清洗

小(xiao)心(xin)棄去上清，緩慢地沿離心(xin)管(guan)(guan)壁(bi)加入75％的(de)乙(yi)醇1 ml（切勿觸及沉淀），輕(qing)輕(qing)上下顛倒洗滌(di)離心(xin)管(guan)(guan)管(guan)(guan)壁(bi)，12,000 rpm，4 ℃離心(xin)2 min后小(xiao)心(xin)棄去乙(yi)醇（為了更好地控制RNA中的(de)鹽離子含量，應盡量除(chu)凈乙(yi)醇），重復洗滌(di)一(yi)次。

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4.??????RNA的溶解

室溫干(gan)燥(zao)沉(chen)(chen)淀(dian)2-5 min（不可以離(li)心或加熱干(gan)燥(zao)，否則RNA將會很(hen)難溶解(jie)），加入適量的RNase-free水溶解(jie)沉(chen)(chen)淀(dian)，必要時可用移液槍輕輕吹打(da)沉(chen)(chen)淀(dian)，待(dai)RNA沉(chen)(chen)淀(dian)完全(quan)溶解(jie)后于-80℃保存(cun)。