通用RNA提取試劑盒

產品組分

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需要自備的溶液

●??氯仿

●??無水乙醇

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產品說明

通用RNA提取試劑盒是經過改進開發的新一代產品，提高了裂解液的裂解能力和提取的靈敏度，通過在特定適宜的條件下特異、可逆地結合RNA，而各種蛋白質和其他雜質均可被去除掉，同時改進的硅基質膜增強了對RNA的吸附能力，得到的RNA純度更好，質量更高。該試劑盒可從各種細胞或組織中快速提取總RNA，每個吸附柱每次可處理50–100 mg?組織或5×10⁶?細胞，可(ke)同(tong)時處理大量不同(tong)樣品，一個小時內(nei)即可(ke)完成反應。提取的(de)總RNA沒有DNA和(he)蛋白的(de)污染，可(ke)用于(yu)Northern blot、Dot blot、polyA?篩選、體外翻(fan)譯、RNase保護分析和(he)分子克隆等。

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保存條件

溶液(ye)RL應在2-8℃避光保(bao)存(cun)，其他溶液(ye)和純化柱室溫保(bao)存(cun)。

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注意事項---------------------------------------------------------------------------------------------------------
●??初(chu)次使(shi)用(yong)溶液(ye)(ye)RPI和溶液(ye)(ye)RW前，需按(an)比(bi)例加(jia)入(ru)無(wu)水乙醇。18 ml溶液(ye)(ye)RPI中(zhong)加(jia)入(ru)12 ml無(wu)水乙醇（3:2），12 ml溶液(ye)(ye)RW中(zhong)加(jia)入(ru)48 ml無(wu)水乙醇（1:4）。

●??嚴防操作環境、使用的容器、耗材(cai)和試劑的RNase污染。操作過程中勤換手套。

●??使用(yong)本產品(pin)提取的(de)RNA一般不含有(you)DNA污染。在極少數情況下（與組織pH值等(deng)相(xiang)關），如果(guo)有(you)DNA污染而又必須去(qu)除(chu)，則可以用(yong)RNase-free的(de)DNase處理樣品(pin)。

●??請嚴格遵照操作步(bu)驟操作。

●??不同(tong)起始材料的用(yong)(yong)量(liang)(liang)及溶液(ye)RL的用(yong)(yong)量(liang)(liang)不同(tong)（參見下(xia)表），過(guo)多或過(guo)少的使用(yong)(yong)量(liang)(liang)都可能(neng)影響RNA的質量(liang)(liang)或產量(liang)(liang)。若起始材料量(liang)(liang)很(hen)少，RNA預計產量(liang)(liang)很(hen)低，在異丙(bing)醇沉(chen)淀時，可加入20mg/ml的肝糖原溶液(ye)0.5-1 μl促進RNA沉(chen)淀。

●??有關(guan)RNA的吸光度說明(ming)如下(xia)：

260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光(guang)度(du)分別代表核(he)酸、背景（溶液(ye)渾濁度(du)）、鹽(yan)濃度(du)和蛋白(bai)(bai)質(zhi)等有機(ji)物(wu)的污染程度(du)，質(zhi)量較(jiao)好的RNA的R值應在1.8-2.0之(zhi)間，當R<1.8時(shi)，溶液(ye)中的蛋白(bai)(bai)質(zhi)等有機(ji)物(wu)的污染比較(jiao)明(ming)顯(xian)；當>2.2時(shi)，說明(ming)RNA已經被(bei)水(shui)解(jie)成(cheng)單核(he)苷酸。

●??RNA濃度=（OD₂₆₀-OD₃₂₀）*稀釋倍數*0.04 μg/μl。

操作步驟---------------------------------------------------------------------------------------------------------

第一(yi)次使用前應在(zai)溶液?RPI、溶液?RW中加(jia)入無水乙(yi)醇，加(jia)入量請(qing)參見瓶上(shang)標簽。

1. ?樣品處理

●?組織(zhi)(zhi)：將組織(zhi)(zhi)在液氮中磨碎。每50–100 mg組織(zhi)(zhi)加1 ml溶液RL，用(yong)勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積(ji)不應超過(guo)溶液RL體積(ji)的十(shi)分(fen)之一。

●?單層培養細胞：直接在培養板中加入溶液RL裂解細胞，每10 cm^2?面積加1 ml溶液RL。用取樣器抽打幾次。

●??溶液(ye)RL的加(jia)入量(liang)根據(ju)培(pei)養瓶面(mian)積決(jue)定，不是由(you)細胞數決(jue)定。如果加(jia)量(liang)不足(zu)，可能導致提取的RNA中有DNA污染。

c. ?細胞懸液：離心取細胞，棄上清。每5–10×10⁶動物細(xi)胞和(he)植物細(xi)胞加入1 ml溶液RL。加溶液RL前不要洗滌細(xi)胞，以(yi)免(mian)降(jiang)解mRNA。

2. ?將勻(yun)漿樣(yang)品在15–30℃放置5 min，使得核酸蛋白(bai)復合(he)物完全分離。

3. ?可(ke)選步(bu)驟(zou)：4℃ 12,000 rpm (~13,400×g)?離心(xin)5分鐘，取上清(qing)，轉(zhuan)入一個新的(de)無(wu)RNase的(de)離心(xin)管中。

●??如果樣品(pin)中(zhong)(zhong)含有(you)較(jiao)多蛋白、脂肪、多糖(tang)或(huo)肌(ji)肉、植物結節部(bu)分等，可加(jia)此步驟離心去除。離心得(de)到(dao)的沉淀中(zhong)(zhong)包(bao)括細胞外膜、多糖(tang)、高(gao)分子量(liang)DNA，RNA存在于(yu)上清溶液(ye)中(zhong)(zhong)。

（如樣品(pin)含(han)有較多(duo)多(duo)糖多(duo)酚，請增加以下步驟，在(zai)上清(qing)液(ye)中加入0.2×上清(qing)液(ye)體積的5 M NaCl及1×上清(qing)液(ye)體積的酚/氯仿(fang)（1:1），混勻，12000 rpm?離心(xin)5-10 min?，取上清(qing)液(ye)加入等體積氯仿(fang)，混勻，12000 rpm?離心(xin)5-10 min，至第(di)4步。）

4. ?加入(ru)200 μl氯仿(fang)，蓋(gai)好管蓋(gai)，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min。

5. ?4℃ 12,000 rpm離心10 min，樣(yang)品會分成(cheng)三層(ceng)，從上至(zhi)下依次是：無色的水相(xiang)(xiang)，白色的中間層(ceng)和黃色的有機相(xiang)(xiang)，RNA主要存在(zai)于水相(xiang)(xiang)中，水相(xiang)(xiang)的體積約為所用(yong)溶(rong)液RL試劑的60%。把水相(xiang)(xiang)轉移到新管中，進行(xing)下一步操(cao)作。注意不要吸到中間層(ceng)。

●??第一次使用前(qian)應在(zai)溶液?RPI、溶液RW中加入(ru)無水(shui)乙(yi)醇(chun)，加入(ru)量請參(can)見瓶上標簽。

6. ?緩慢加入0.5?倍體積無水乙醇，混勻（此時可能會出現沉淀）。將得到溶液和沉淀一起轉入純化柱中，4℃ 12,000 rpm離心30 s。4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄掉收集管中的廢液。
●??若溶液(ye)體(ti)積大(da)于純化柱容積（700 μl），可分兩次離心。

7. ?向純化柱中加入500 μl溶液RPI（使用前請先檢查是否已加入乙醇），4℃ 12,000 rpm離心30 s，棄廢(fei)液。????

8. ?向純化柱中加入500 μl溶液RW（使用前請先檢查是否已加入乙醇），室(shi)溫(wen)靜置2 min，?4℃ 12,000 rpm離(li)心(xin)30 s，棄廢液。

9. ?向(xiang)純(chun)化(hua)柱中加(jia)入(ru)500 μl溶液RW，室溫靜置(zhi)2分鐘，4℃ 12,000 rpm離心30 s，去除殘余液體。

10. ?將純化(hua)柱(zhu)放入(ru)2ml收集管中，4℃ 12,000 rpm離心2 min，去(qu)除殘(can)余液(ye)體。

●??此(ci)步驟的(de)目的(de)是將純化柱中(zhong)殘(can)余(yu)的(de)漂洗液去(qu)除，離心(xin)后將純化柱在室溫放置片刻，或置于超凈工作臺(tai)上通風片刻，以(yi)充分晾(liang)干。如果有漂洗液殘(can)留，可能會影響后續的(de)RT等實驗操作。

11. ?將純化柱轉入一個新的離心管中，加30–100 μl RNase-free ddH₂O，室溫放(fang)置2 min，4℃ 12,000 rpm離心2 min。

●??洗脫緩沖液體積不應少于30 μl，體積過小影響回收效率。且RNA應保存在-70℃（-80℃），以防(fang)降解。

●??如果想(xiang)提高RNA得(de)率(lv)，可(ke)重(zhong)復上步操作一次(ci)，合并(bing)兩次(ci)得(de)到的(de)溶液。

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