通用菌落PCR檢測試劑盒
Cat. #：P8011，P8012
產品簡介
本試劑盒利用(yong)PCR原理(li)，結合本公司的(de)快速(su)DNA聚合酶（延伸(shen)速(su)率20s/kb），設計(ji)適用(yong)性(xing)廣的(de)最佳引(yin)物，優化(hua)(hua)PCR反(fan)應緩(huan)沖體系，同時簡化(hua)(hua)檢測方法，可(ke)用(yong)于各種(zhong)常用(yong)T載(zai)體克隆的(de)篩選(xuan)檢測。
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產品組成
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Component |
P8011 |
P8012 |
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2× FSTM?Mix |
500 μl |
1 ml × 5 |
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T-primer (10 μM) |
50 μl |
500 μl |
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超純水 |
1 ml |
1 ml × 10 |
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說明書 |
1份 |
1份 |
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活性定義
一個(ge)活性單(dan)位（U）指用活性化的大(da)馬哈魚精子DNA作為模板/引物，在(zai)72℃、30 min內，攝入10 nmol全(quan)核(he)苷酸(suan)所需的酶量。
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保存條件
-20℃保存。
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質量控制
純度(du)檢(jian)測(ce)(ce)：經質量檢(jian)測(ce)(ce)，產品不含脫氧(yang)核(he)(he)(he)糖(tang)核(he)(he)(he)酸內切酶(mei)、脫氧(yang)核(he)(he)(he)糖(tang)核(he)(he)(he)酸外切酶(mei)和核(he)(he)(he)糖(tang)核(he)(he)(he)酸酶(mei)污染。
功能檢(jian)測(ce)：PCR方(fang)法檢(jian)測(ce)本試劑盒無(wu)宿主殘余DNA，也無(wu)其他DNA污染(ran)，能有效完(wan)成PCR擴(kuo)增。
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應用舉例
1.?準備樣品
將過夜培養的平板上(shang)(shang)的菌落(luo)編號后，用(yong)滅(mie)菌的牙簽挑取(qu)單(dan)克隆菌體的一部分(fen)至(zhi)(zhi)反應體系中(zhong)；或在1.5 ml EP管中(zhong)分(fen)裝500 μl含有相應抗生素(su)的LB培養基，并做好標記，用(yong)無(wu)菌牙簽提取(qu)單(dan)個菌落(luo)至(zhi)(zhi)上(shang)(shang)述(shu)培養基中(zhong)，37振(zhen)蕩（250-300rpm）培養4h，取(qu)1-2 μl菌液用(yong)于擴(kuo)增。
2.?配制反應體系
請于冰上配置反應體系，體系大小與組分用量與添加順序可調整：
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Ordinal |
Component |
Volume (20 μl reaction volume) |
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1 |
2× FSTM?? Mix |
10 ? μl |
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2 |
T-primer (10 μM)* |
1 μl |
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3 |
菌體或菌液 |
1 μl |
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4 |
超純水 |
To ? 20 μl |
*包含了上下游引物，擴增大小約為：克隆片段+250 bp。
●?加入各(ge)組分(fen)后，請用(yong)槍頭(tou)反復吸吹(chui)幾(ji)次，充分(fen)混勻。
●?在一次(ci)配制(zhi)多管需分裝時(shi)建(jian)議按（n+1）的反(fan)應液(ye)量配制(zhi)，以確保分配時(shi)的耗損不會影響(xiang)實驗，同時(shi)選擇大于(yu)總體積的離心管便于(yu)混勻。
●?如需(xu)使用其他體積的(de)PCR反(fan)應體系，請按(an)各組(zu)分比例縮減(jian)或增(zeng)加各組(zu)分用量。
●?將(jiang)混(hun)勻的(de)各管短暫離(li)心，置(zhi)于PCR儀(yi)中(zhong)。
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3.?設定反應程序進行PCR反應
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Stage ? |
Temperature |
Time |
Number ? of Cycles |
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Initial ? Denaturation |
94℃ |
3 ? min |
1 |
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Denaturation |
94℃ |
30 ? sec |
30 |
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Annealing |
55℃ |
30 ? sec |
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Extension |
72℃ |
30 ? sec or 45 sec |
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Final ? Extension |
72℃ |
5 ? min |
1 |
●?設定PCR程(cheng)序時(shi)，請根據目的片段大(da)小(xiao)決定延(yan)(yan)伸(shen)時(shi)間(jian)(jian)，如果(guo)目的片段大(da)小(xiao)為(wei)500 bp時(shi)，延(yan)(yan)伸(shen)時(shi)間(jian)(jian)為(wei)15 sec；500 bp-1 kb，延(yan)(yan)伸(shen)時(shi)間(jian)(jian)20 sec；目的片段>1 kb時(shi)，延(yan)(yan)伸(shen)時(shi)間(jian)(jian)按20s/kb計算。
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3.?分析結果
反(fan)應(ying)結(jie)束后取(qu)2-5 μl反(fan)應(ying)產物與loading buffer混勻后進行瓊(qiong)脂糖凝膠(jiao)電泳(yong)，通過(guo)凝膠(jiao)成像(xiang)設備觀(guan)察目(mu)的條帶的擴增情況。
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注意事項
請(qing)嚴格按照說明(ming)書提(ti)供(gong)的(de)實驗體系及實驗條件進(jin)行(xing)試驗。
室溫下DNA聚合酶有一定的活性，為避免發生非特異性擴增，請于冰上配置反應體系，并且最后添加FSTM?Mix或模板DNA。
挑取(qu)菌(jun)落時，應選擇單菌(jun)落，不要挑取(qu)太多菌(jun)體，以免(mian)影(ying)響PCR結果(guo)。
部分適用T載體參考下表：
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公司 |
T載體 |
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Promega |
pGEM-T ? Vector |
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pGEM-T ? Easy Vector |
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Takara |
pMD18-T ? Vector |
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pMD19-T ? Vector |
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pMD20-T ? Vector |
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pMD18-T ? Simple Vector |
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pMD19-T ? Simple Vector |
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pSIMPLE-18 ??EcoR?V/BAP Vector |
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pSIMPLE-19 ??EcoR?V/BAP Vector |
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Tiangen |
pGM-T載體 |
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pBS-T載體 |