DNA 電(dian)泳(yong)(yong)是分子生物學(xue)實(shi)驗(yan)的“基(ji)本(ben)功”，幾(ji)乎(hu)所有科研人(ren)員都繞不(bu)開。雖然操作看似簡(jian)單，但(dan)原(yuan)理與細(xi)節(jie)不(bu)少(shao)，一(yi)旦忽視就可能(neng)導致條(tiao)帶模糊、結果失真(zhen)(zhen)，甚至實(shi)驗(yan)“全軍覆沒(mei)”。今天我們(men)來拆解(jie)幾(ji)個常見的誤(wu)區(qu)，從理論到實(shi)踐，幫你真(zhen)(zhen)正理解(jie)電(dian)泳(yong)(yong)原(yuan)理，少(shao)走彎(wan)路。

???原理回顧：DNA 為什么能“跑起來”？

DNA電泳(yong)過程示(shi)意圖

DNA 電泳依賴的是?電場驅動：帶負電荷的 DNA 分(fen)子在電場(chang)中向正極遷移。遷移速度主要受以下因素影響：

分子大小：小(xiao)分子 DNA 在凝膠孔隙中阻力小(xiao)，遷移更快。

瓊脂糖濃度：濃度越高，凝(ning)膠網(wang)孔越密，分(fen)辨小分(fen)子的能力更強。

電壓與緩沖液：電壓(ya)過(guo)高會導(dao)致發熱，緩沖液離(li)子濃度不當(dang)會影響(xiang)電流(liu)與分(fen)辨率。

核酸構象：線(xian)性 DNA、超螺旋(xuan)質(zhi)粒(li)(li)(li)、開(kai)環質(zhi)粒(li)(li)(li)遷移速度各不相(xiang)同，超螺旋(xuan)質(zhi)粒(li)(li)(li) > 線(xian)性 DNA > 開(kai)環質(zhi)粒(li)(li)(li)。

超螺旋質粒（Supercoiled DNA）構象緊密，分(fen)子(zi)呈現高度壓縮狀態(tai)。在凝(ning)膠孔隙中受到的阻力最(zui)小 → 遷移速度最(zui)快。

線性 DNA（Linear DNA）構(gou)象伸(shen)展，遷移(yi)速度主要取決于分子大小(xiao)。一般情況(kuang)下，速度介于超螺旋和(he)開環之間。

開環質(zhi)粒（Nicked/Relaxed Circular DNA）因單鏈切口(kou)導致環形(xing)松弛，構象最(zui)“蓬松”。在(zai)凝(ning)膠中阻(zu)力(li)最(zui)大 → 遷移速度最(zui)慢。

理解(jie)這些原理，才能真(zhen)正避(bi)免(mian)實驗中“看不懂”的現象。

???常見誤區一：瓊脂糖濃度隨意配

瓊(qiong)脂糖是(shi)從海藻中提(ti)取的(de)(de)一種線性聚合物，加熱溶解后再冷(leng)卻會(hui)形成具有網(wang)狀結構的(de)(de)凝膠。這個網(wang)絡就(jiu)像一個個篩孔。

瓊脂糖濃度對遷移率和分辨率的具體影響：

a. 對遷移率（Mobility）的影響

對于同一大小的DNA片段，瓊脂糖濃度(du)越(yue)高(gao)，其受到(dao)的阻(zu)力(li)越(yue)大，遷(qian)移(yi)速度(du)越(yue)慢。反之，濃度(du)越(yue)低(di)，遷(qian)移(yi)越(yue)快。

因此，在不(bu)同濃度的(de)凝膠上(shang)，同一(yi)個(ge)DNA片段的(de)遷移位置是不(bu)同的(de)，不(bu)能直接比較。

b. 對分辨率（Resolution）的影響

分辨率是指將大小相近的DNA片(pian)段分離開的能力(li)。這是瓊脂糖濃度最重要的影響。

• 低濃度凝膠（如0.5%-0.8%）：

篩孔大，允許(xu)大片(pian)段DNA（>10 kb）有效分離。小片(pian)段DNA跑得飛快(kuai)，但彼此(ci)之間難以分開(kai)，會擠在一起形成模糊的(de)一條(tiao)帶。

優點：適合分離大片段DNA。

缺點：凝膠(jiao)非常脆弱柔軟(ruan)，容易破損。

• 中等濃度凝膠（如0.8%-2.0%）：

這是最(zui)常用的(de)(de)范圍，提供(gong)了(le)一個(ge)良好(hao)的(de)(de)平衡，能有效分離(li)0.5 kb - 10 kb范圍內的(de)(de)DNA片段，足以滿足大多數常規實驗(yan)（如質(zhi)粒、PCR產物(wu)、酶切產物(wu)的(de)(de)鑒定）。

1%與1.7%瓊脂糖(tang)凝膠外觀對比

1%與1.7%瓊脂糖凝膠分辨(bian)率(lv)對比

M1: 100bp Ladder;?M2: DS2000;?M3: DS5000;?M4: 1kb Ladder

 

• 高濃度凝膠（如2%-3%）：

篩(shai)孔小，能(neng)很好地(di)分離小片段DNA（<1 kb），甚至能(neng)分辨出幾(ji)(ji)十個堿基對的差(cha)異。大片段DNA則幾(ji)(ji)乎(hu)無法(fa)移動，停留在(zai)加(jia)樣(yang)孔附近(jin)。

優(you)點：對小片段(duan)DNA分辨率(lv)極高。

缺點：凝膠脆(cui)性大(da)，易碎。

?? 濃度錯誤直接導致分辨(bian)率(lv)下降(jiang)，大片(pian)段跑不動(dong)，小片(pian)段跑成一團。

 

???常見誤區二：電壓越高越好

瓊脂糖(tang)凝膠電(dian)泳里電(dian)壓是(shi)個(ge)很關鍵的因素，直接影響到DNA/RNA 遷移速度、條(tiao)帶(dai)清晰(xi)度和(he)分(fen)離效果。

1. 電壓與遷移速度

• 高電壓 → 分子遷移更快：電(dian)場力更強，帶負電(dian)的(de)核酸(suan)分子快速向正極移動。

• 低電壓 → 遷移較慢：分離過(guo)程更溫(wen)和(he)，條帶移(yi)動(dong)較慢(man)。

2. 電壓與分辨率

• 低電壓（常用 4–6 V/cm）：遷移慢，但小片段與大片段的(de)(de)分離效果(guo)更好，分辨(bian)率高，適合(he)區(qu)分相鄰大小的(de)(de)條帶。

• 高電壓（>10 V/cm）：條帶跑(pao)得(de)快，但容易拉寬、拖尾，分辨率下降。

4V/cm、7V/cm、9V/cm電壓分辨率對比

M1: 100bp Ladder;?M2: DS2000

3. 電壓與熱效應

• 高電壓 → 產生焦耳熱：緩沖液升溫，凝膠變軟甚至熔化，導致條帶彎曲(qu)（smiling bands，笑臉效應）。

• 散熱不足：DNA 遷移速(su)率不均勻，上下條帶(dai)彎曲，DNA降解，影(ying)響(xiang)結果準確性。

• 解決辦法：降(jiang)低電壓，或(huo)者在(zai)低溫條件下電泳（冰盒、電泳槽(cao)加冰袋）。

9V/cm電(dian)壓下不同電(dian)泳時(shi)間對比

M3: DS5000;?M4: 1kb Ladder

4. 實驗常用電壓范圍

• 常規瓊脂糖凝膠（0.7–2%）：4–10 V/cm（電(dian)壓與電(dian)泳(yong)槽兩電(dian)極間(jian)距離有關）。

• 小片段 DNA 分離（幾十到幾百 bp）：可稍高電壓(ya)（8–10 V/cm）。

• 大片段 DNA（>10 kb）：應低電壓（3–5 V/cm），防止擴(kuo)散(san)和分辨(bian)率丟失。

電(dian)壓(ya)越(yue)高，電(dian)泳越(yue)快，但分辨率和凝膠(jiao)完整性可能受影響；低電(dian)壓(ya)遷移慢，卻能獲得更(geng)清(qing)晰(xi)、更(geng)可靠的分離效果(guo)。

?? 推薦?5–10 V/cm，電(dian)極間距(ju) 20 cm 時(shi)，電(dian)壓保持在 100–200 V 之間。

???常見誤區三：只靠上樣染料定位

上樣緩沖液(ye)是(shi)DNA電(dian)泳中不(bu)可或(huo)缺的(de)組(zu)成部分，它通常含有兩種主要成分：

1. 惰性染料（如溴酚藍、二甲苯青）：用于實時監控電泳進程。
2. 增稠劑（如甘油、蔗糖、Ficoll）：增加樣品密度，確保樣品沉入加樣孔底部。

染料(liao)在電泳中(zhong)起到了(le)“視覺參考(kao)線”或“前(qian)鋒”的作用，其定(ding)位功能主要體(ti)現(xian)在：

1. 指示電泳進程，統一上樣基準。
2. 預估DNA片段的遷移位置：
   • 不同的染料在不同濃度的瓊脂糖凝膠中，其遷移行為與特定大小的DNA片段相似。因此，它們可以用來粗略估計未知DNA條帶的大小。
   • 溴酚藍（Blue：在0.8%-1.0%的瓊脂糖凝膠中，其遷移速度大約與300-500 bp的DNA片段相當。
   • 二甲苯青（Blue：在0.8%-1.0%的瓊脂糖凝膠中，其遷移速度大約與4000-5000 bp的DNA片段相當。
   • 例如：?如果你看到溴酚藍條帶快跑出凝膠了，你就知道所有小于500 bp的DNA片段可能已經接近凝膠底部，即將跑出。

???不能憑染料位置判斷片段大小，這也是為什么 DNA Marker 在電泳中不(bu)可或缺。

???常見誤區四：Marker 隨便用

在(zai)分子(zi)生物學實驗中(zhong)(zhong)，DNA Marker常(chang)被簡(jian)單視為泳道中(zhong)(zhong)的“對照”或“標尺(chi)”，但它(ta)的作用(yong)遠不止于此。Marker的選擇直接決定了實驗數據的可解釋性、準確性和美觀度，是實驗設計中最容易被忽視卻至關重要的一環。一個不合適的Marker可能導致整個實驗結果失去價值。

低質量或不匹配Marker帶來的三大問題：

1. 片段分布稀疏：導致大小判斷“失準”
   • 問題：?當Marker的條帶間隔過大，或恰好在你目標片段的關鍵區域缺少條帶時，你無法進行精確的插值估算。例如，如果你的PCR產物在750 bp左右，而Marker僅在500 bp和1000 bp有條帶，你只能模糊地估計產物大小在“500到1000 bp之間”，無法得出準確結論。
   • 后果：?實驗數據的精確度大打折扣，無法滿足克隆鑒定、酶切驗證等對大小要求嚴格的實驗需求。
2. 條帶模糊拖尾：影響結果呈現與可信度
   • 問題：?由于保存不當、反復凍融或生產工藝問題，Marker條帶可能出現擴散、模糊或強度不均（有的亮有的暗）。這不僅影響觀察，更嚴重影響成像質量。
   • 后果：?在論文、報告或展示中，模糊的Marker會讓整個實驗結果顯得不專業、不可靠，降低數據的可信度。審稿人或同行可能會因此質疑你的實驗嚴謹性。
3. 缺少關鍵指示條帶：降低實驗效率
   • 問題：?許多高效能的Marker會在500 bp、1000 bp、1500 bp和2000 bp等關鍵位置設置特別亮、特別粗的“指示條帶”或“參考條帶”。
   • 后果：?缺少這些指示條帶，你在快速瀏覽凝膠時就無法瞬間定位。你需要花費額外的時間去數條帶、比對大小，大大降低了實驗分析的效率。尤其在處理多個樣品時，這種效率損失尤為明顯。

如何選擇一個“合理”的Marker？

一個優秀的(de)(de)(de)Marker不應只是DNA片段的(de)(de)(de)簡(jian)單(dan)集合，而應是一個精心(xin)設計(ji)的(de)(de)(de)測量(liang)工(gong)具(ju)。以下是選擇標準：

???1. 覆蓋合適的片段范圍
這是最基本的要求。選擇的Marker其條帶范圍必須將你的目標DNA片段“包圍”在中間，而不是落在兩端。例(li)如：

• 常規PCR產物鑒定（100 bp - 2 kb）：?選擇范圍覆蓋100 bp至2000 bp的Ladder，如著名的100 bp Plus Ladder或1 kb Plus Ladder。
• 大片段酶切或基因組DNA分析（>5 kb）：?應選擇λ DNA HindIII digest等大片段Marker。
• 小片段 miRNA/siRNA 分析（<100 bp）：?需要專門的低分子量Marker。

???2. 條帶清晰、濃度均一

• 清晰銳利：?每條帶都應邊界清晰，無拖尾或擴散現象，這表明生產工藝好且保存得當。
• 亮度均一：?理想狀態下，所有條帶應具有相近的亮度（即DNA含量一致），這確保了不同大小的條帶都能被清晰成像，不會出現小條帶看不見、大條帶又過曝的情況。

???3. 含有突出的指示條帶，便于快速定位

• 這是區分“優秀”Marker和“普通”Marker的關鍵。許多高端Marker會特意將500 bp和1000 bp（有時還包括1500 bp和2000 bp）的條帶做得更濃、更亮。
• 好處：?在紫外燈下，你的眼睛能立刻抓住這幾個“地標”，瞬間建立起凝膠的空間距離與分子大小的對應關系，無需仔細數格子，極大提升了判讀效率。

???常見誤區五：忽略緩沖液與染料差異

在(zai)瓊脂糖凝膠電(dian)泳(yong)中，新手(shou)往往將全部注意(yi)力集中在(zai)瓊脂糖濃度和電(dian)壓設(she)置上，而忽略(lve)了兩(liang)個同樣至(zhi)關重(zhong)要的因素：電泳緩沖體系和核酸染料。它們(men)并(bing)非(fei)“通用”的試(shi)劑，其選(xuan)擇(ze)(ze)直接影響DNA的遷移率、條帶分(fen)辨率和實驗安全性，錯誤的選(xuan)擇(ze)(ze)會悄(qiao)然破(po)壞你的實驗結(jie)果。

一、電泳緩沖液：不僅僅是導電的溶液

最(zui)常用的緩沖液(ye)是TAE和(he)(he)TBE，它們化(hua)學成分不(bu)同(tong)，決(jue)定(ding)了其特(te)性(xing)和(he)(he)適用場景(jing)截然不(bu)同(tong)。

?? 如何選擇？

• 首選TAE的情況：?進行大片段DNA分離（如基因組DNA酶切）、DNA膠回收（兼容性更好）或需要快速電泳時。
• 首選TBE的情況：?進行小片段DNA分離（如PCR產物、SSR分析）、高分辨率電泳（如區分相差幾十bp的條帶）或需要長時間電泳時。

?? 重要提示：絕對不可將TAE和TBE緩沖液或其濃縮母液混用！?這會(hui)導致pH和離子強度(du)異常，產生(sheng)不可預測的遷移結果(guo)。

二、核酸染料：安全與效能的權衡

染料的選擇關乎實驗結果的清晰度和(he)操(cao)作者(zhe)的生命安全。

?? 如何選擇？

• 追求成本與靈敏度：?可能仍在用EB染料，但必須配備嚴格的防護和廢物處理流程。

• 追求安全與便捷（現代實驗室首選）：AIE-Gelgreen或GelRed是更安全的選擇，尤其適合教學實驗室或沒有專門EB處理設施的實驗室。它們通常與藍光成像系統配套，能最大程度減少對DNA的損傷（UV會使DNA產生嘧啶二聚體，影響下游實驗）。
• 注意：?如果實驗下游需要進行膠回收克隆，建議選擇對酶活影響更小的染料。

總結與實驗設計指南

忽略(lve)緩沖(chong)液(ye)和染料的選擇，就像用錯誤的尺子和昏暗的燈(deng)光去(qu)測量(liang)一(yi)個精(jing)細(xi)的零(ling)件。

?? 在設計實驗時，請遵循這個流程進行選擇：

• 看片段大小：
  • 大片段(>5 kb)?→ 優先選TAE緩沖液。
  • 小片段(<1 kb)?→ 優先選TBE緩沖液，以獲得更高分辨率。
• 看實驗目的：
  • 常規鑒定?→ 可選擇性價比高的方案（如DSView染料、EB染料）。
  • 膠回收?→ 優先選TAE?+?對酶活無抑制的染料（如AIE-Gelgreen）。
  • 發表級高清圖片?→ 優先選高分辨率緩沖液(TBE)?+?高靈敏度/低背景的染料（如AIE-Gelgreen）。

AIE-Gelgreen核酸凝膠染料

• 看安全性與成本：
  • 安全絕對優先?→ 毫不猶豫地選擇AIE-Gelgreen等安全染料和藍光成像系統，即使成本稍高。
  • 權衡遷移準確性 → 如果擔心某些染料影響遷移，可在Marker和樣品中使用完全相同的上樣緩沖液和染料負載，以消除誤差。

因此，將緩沖液和染料視為與凝膠濃度、電壓同等重要的核心實驗參數，根據你的(de)具(ju)體需求進行(xing)理性(xing)選(xuan)擇(ze)，是獲(huo)得可(ke)靠、美觀、安全(quan)實驗結果的(de)必備步驟。

 

??小結

DNA 電泳(yong)看似“基礎(chu)”，卻(que)暗藏不少原(yuan)理性細節。掌握濃度(du)、電(dian)壓、緩沖液、Marker 與染(ran)料的選擇規(gui)律，才能(neng)保證(zheng)結果：

• 條帶清晰

• 分辨率高

• 實驗可重復、可展示

 

?東盛相(xiang)關(guan)產(chan)品?

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